禾谷缢管蚜体内与传播WYDV-GPV相关的蛋白的筛选和鉴定

【摘要】小麦病毒病是全球冬小麦产区小麦上经常发生的一类重要病害，由黄矮病毒（yellowdwarfviruses，YDVs）单一侵染或混合侵染引起。黄矮病毒经由多种麦蚜以持久型方式传播。病毒-蚜虫的互作关系成为病毒-蚜虫-小麦这一病害体系中的关键因素。病毒编码的蚜传相关蛋白和蚜虫体内参与病毒传播的蛋白之间的互作是病毒-蚜虫互作关系的分子证据，而参与传播黄矮病毒相关的蚜虫蛋白都停留在正向遗传学手段的筛选阶段。本研究中，利用中国特有的黄矮病毒种类-小麦黄矮病毒WheatYellowDwarfVirus-GPV（WYDV-GPV）和其传播介体禾谷缢管蚜（Rhopalosiphumpadi）为研究对象，利用反向遗传学方法酵母双杂交（GAL4酵母双杂交系统和split-ubiquitin膜酵母双杂交系统）来筛取参与传播WYDV-GPV相关的禾谷缢管蚜蛋白，并同时运用酵母双杂交系统和化学发光免疫共沉淀（ChemiluminescentCo-immunoprecipitation，Co-IP）来验证病毒蛋白和蚜虫蛋白的遗传方面和物理方面的双重互作，最终得到真正的参与传播黄矮病毒的蚜虫蛋白。将WYDV-GPV编码的蚜传相关蛋白外壳蛋白（CP）和通读蛋白（RTD）的基因分别插入到GAL酵母双杂交系统的诱饵载体质粒pGBKT7-DB上，构建了pGBKT7-CP和pGBKT7-RTD两个诱饵质粒。后续实验结果表明，这两个诱饵质粒对该系统的Y2HGold酵母菌株无毒性，在该酵母细胞中能够表达出正确的诱饵蛋白，并且表达出的诱饵蛋白没有自激活活性，因此这两个诱饵满足了可用于筛取文库的条件。利用禾谷缢管蚜全虫总RNA构建的cDNA酵母文库，转化率为5×106cfu/ug，独立克隆数为4×106个/ml，库滴度为5.12×107cfu/ml，这些参数均符合文库构建的各项参数。使用mating法进行诱饵质粒筛取酵母文库的过程，结果pGBKT7-CP没有筛到蛋白，pGBKT7-RTD筛到了3个蛋白，分别为推测蛋白(LOC100158933)、核糖体蛋白大亚基31（Rpl31）和核糖体蛋白大亚基12（Rpl12）。筛到的蛋白种类少、数量少，可能是该系统并不适合用于研究病毒-蚜虫互作。同时，将WYDV-GPV的CP和RTD基因分别插入到另一个酵母双杂交系统，即split-ubiquitin膜酵母双杂交系统的诱饵载体质粒pDHB1上，构建了pDHB1-CP和pDHB1-RTD两个诱饵质粒。功能检测结果表明，这两个诱饵质粒在该系统的NMY-51酵母中，表达出了正确的具备筛库功能的诱饵。利用这两个诱饵质粒从禾谷缢管蚜全虫总RNA构建的cDNANubG-X质粒文库中筛取互作蛋白，最后，pDHB1-CP筛到了9个功能蛋白和3个推测蛋白，pDHB1-RTD筛到了24个功能蛋白和5个推测蛋白。从这些蛋白中，选取5个pDHB1-CP筛到的蛋白（Emi、Pan、LOC、Naca和CV4），22个pDHB1-RTD筛到的蛋白（Comx、Nar、TCP、CVa、Gps、Naca、OSD、Cup、Vha、Ft3、UL36、LOC、Cu(I)、GRIK3、CV4、Pan、p450、Ubi、Jagn1、TrI、Pro3和Tsr），利用Split-ubiquitin膜酵母双杂交系统进行与相应诱饵蛋白的二次互作验证和X-β-半乳糖苷酶检测，结果发现，CP与其5个猎物蛋白都有较强的互作，RTD与其猎物蛋白Nar、TCP、CVa和pro3存在较弱的互作关系，与猎物蛋白UL36可能不发生互作，与剩余17个猎物蛋白存在较强的互作。选择split-ubiquitin膜酵母双杂交体统筛到的感兴趣的猎物蛋白，借助于化学发光Co-IP验证其与诱饵蛋白的物理互作，最终确定了7个猎物蛋白与WYDV-GPVRTD之间存在较强的物理互作，依次分别是Pan、TrI、Tsr、Comx、Naca、CV4和p450，其中Pan与WYDV-GPVCP之间也有一定强度的互作；所选CP其他的猎物蛋白与CP都几乎不发生物理互作。Pan与RTD之间既有强的遗传互作也有强的物理互作，这种结果使得Pan成为后续研究的重点。依据5‘RACE得到的Pan全长cDNA序列推测，该基因翻译产物的N端具有脂肪酶的保守功能结构域，但整个Pan蛋白的氨基酸长度（832aa）远远大于一般脂肪酶的长度，即在其C端出现很多氨基酸残基，末端部分与WYDV-GPVRTD发生遗传和物理互作，推测Pan可能在形成包被WYDV-GPV病毒粒子的膜系统过程中起作用。为了后续进行蚜虫蛋白的表达谱和功能分析，本研究还针对带毒蚜虫体系建立了RT-qPCR相对定量检测方法，用于检测在禾谷缢管蚜体内病毒含量和目标基因的表达量。
【作者】武科科；
【导师】吴云锋；
【作者基本信息】西北农林科技大学，植物病理学，2014，博士
【关键词】小麦黄矮病毒；禾谷缢管蚜；酵母双杂交；蛋白互作；免疫共沉淀；

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